直接影響免疫組化檢測結(jié)果的可靠性。在進(jìn)行免疫組化染色時并非所有的抗原都要進(jìn)行抗原修復(fù)，抗原性保存良好或基本保存者不需要修復(fù)。不同抗體必須選擇最適合的修復(fù)方法，最常用的是熱修復(fù)法，尤其是細(xì)胞核抗原經(jīng)熱修復(fù)后，染色效果特別好。熱修復(fù)包括水煮加熱、高壓加熱和微波加熱3種。

熱修復(fù)法影響抗原修復(fù)的關(guān)鍵因素有2個：

①溫度：高壓加熱時間為2～3min，水煮加熱時間為25～30min;

②修復(fù)液的種類和pH值：應(yīng)與修復(fù)方法和修復(fù)時間相對應(yīng)。所以必須嚴(yán)格按照抗體使用說明書進(jìn)行抗原修復(fù)。鑒于抗原修復(fù)的方法較多，在實際工作中，究竟選用何種抗原修復(fù)，應(yīng)根據(jù)抗體種類予以選擇，要清楚影響抗原的因素及各種抗原修復(fù)的方法，必要時可以多種方法同時使用，這樣更具有針對性，標(biāo)記結(jié)果更理想。雖然有學(xué)者認(rèn)為，修復(fù)液沸騰時的氣泡容易導(dǎo)致脫片，但組織處理不佳是最重要的影響因素。

1.5 抗體的選擇及使用

要選擇適宜的一抗，不同的二抗與一抗?jié)舛炔黄ヅ?，都不能得到滿意的結(jié)果。在滴加一抗、二抗時要先輕輕傾去PBS液，選用韌性好、吸水性強(qiáng)的紙巾吸干組織周圍液體，輕壓組織面吸干組織表面水分（不能滑動），防止試劑被稀釋或致濃度不均，立即滴加適量試劑，用細(xì)玻棒將試劑擴(kuò)展至組織外1～2mm，防止出現(xiàn)邊緣效應(yīng)，不能觸碰組織，液面厚約1mm為宜。試劑表面的氣泡用玻棒點破，否則氣泡張力作用會導(dǎo)致局部無試劑，出現(xiàn)氣泡下假陰性反應(yīng)。濕盒孵育要定恒溫，整個過程均要防止干片，孵育時必須加蓋。

1.6 顯色及復(fù)染

DAB顯色劑須現(xiàn)配現(xiàn)用，10min內(nèi)用完。顯色時間也不同程度影響免疫組化的質(zhì)量，最好鏡下控制顯色，一般把握在3～5min，所以操作者應(yīng)具備常用抗體定位的知識。顯色后用蘇木精復(fù)染，注意要淡染。

2.容易被忽視的問題

2.1 試劑的保存

因為抗體是蛋白質(zhì)，保存或使用不當(dāng)不但會造成浪費(fèi)，而且變質(zhì)會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。要注意抗體的有效期，對于一次用不完的抗體可保存在冰箱內(nèi)，而不要放在冷凍室，反復(fù)凍融，抗體效價會急劇下降而失效。同時防止抗體的相互交叉污染和細(xì)菌污染。

2.2 環(huán)境溫度

標(biāo)準(zhǔn)實驗室溫度是18～22℃，實際工作中卻不然，條件差的實驗室冬天可低于12℃，夏天可高于37℃，冬夏溫差可達(dá)到25℃。一切酶促反應(yīng)溫度最關(guān)鍵，反應(yīng)程度也是冬夏季有別，這也是造成染色結(jié)果不穩(wěn)定的一個重要原因，因此應(yīng)該選用37℃恒溫箱進(jìn)行孵育。

2.3 異常染色結(jié)果及原因

①脫片：黏膠玻片不合格、組織固定脫水透明不充分、切片太厚、實驗中干片等；

②花斑狀著色：脫蠟不凈、切片厚薄不勻、切片時組織下有氣泡或組織不規(guī)則松脫、試劑加樣時有氣泡或組織表面殘留水分太多、干片等；

③邊緣效應(yīng)：指組織切緣非正常著色。因一抗二抗加量少，試劑沒有擴(kuò)展至組織外或沒有在封閉濕盒中孵育，水分揮發(fā)使邊緣抗體濃度增大、組織邊緣松脫或干片；

④非特異性背景著色：染色過程中干片或沖洗不徹底；血清蛋白密封不充分；內(nèi)源性過氧化物酶未完全阻斷；內(nèi)源性生物素未阻斷（肝、腎、胰腺，含有中性粒細(xì)胞組織）；固定不及時或固定不佳；切片太厚；緩沖液酸堿度未達(dá)標(biāo)。

綜上所述，人工免疫組化染色操作簡單，但人為及環(huán)境影響因素較多，必須有高度的責(zé)任心和嫻熟的操作技術(shù)，嚴(yán)格按操作流程操作，完善室內(nèi)環(huán)境監(jiān)控，盡可能的減少或杜絕人為和環(huán)境的干擾，才能取得滿意的結(jié)果。