適用范圍
組織學、胚胎學、病理學教學與科研。
原理
易于被堿性或酸性染料著色的性質(zhì)稱為嗜堿性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia );而對堿性染料和酸性染料親和力都比較弱的現(xiàn)象稱為中性(neutrophilia)。
組織內(nèi)的蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的種類很多，它們有不同的等電點。在普通染色法中，染色液的酸堿度為pH6左右，細胞內(nèi)的酸性物質(zhì)如細胞核的染色質(zhì)、腺細胞和神經(jīng)細胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及透明軟骨基質(zhì)等均被堿性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜堿性。而細胞質(zhì)中的其它蛋白質(zhì)如紅細胞中的血紅蛋白、嗜酸粒細胞的顆粒及膠原纖維和肌纖維等被酸性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜酸型。如果改變?nèi)旧旱乃釅A度，pH值升高時，則原來被酸性染料染色的物質(zhì)可變?yōu)槭葔A性;pH值降低時，原來被堿性染料染色的物質(zhì)則可變?yōu)?span>嗜酸性。所以說染色液的pH值可以影響染色的反應。
脫氧核糖核酸(DNA)兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽離子結(jié)合使胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明對比。伊紅是細胞漿的良好染料。
由于組織或細胞的不同成分對蘇木精的親和力不同及染色性質(zhì)不一樣。經(jīng)蘇木精染色后，細胞核及鈣鹽粘液等呈藍色，可用鹽酸酒精分化和弱堿性溶液顯藍，如處理適宜，可使細胞核著清楚的深藍色，胞漿等其它成分脫色。再利用胞漿染料伊紅染胞漿，使胞漿的各種不同成分又呈現(xiàn)出深淺不同的粉紅色。故各種組織或細胞成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點均可顯示出來。
試劑與儀器
A:0.5~1% 的伊紅酒精溶液:
稱取伊紅Y 0.5~1 g，加少量蒸餾水溶解后，再滴加冰醋酸直至漿糊狀。以濾紙過濾，將濾渣在烘箱中烤干后，以95%酒精(即工業(yè)酒精，如果不怕浪費，用無水乙醇配制也可)100毫升溶解。
B:蘇木素染液配方:(配制3000 ml，可按比列減少)
蘇木精6 g
無水乙醇100 ml
硫酸鋁鉀150 g
蒸餾水2000 ml
碘酸鈉1.2 g
冰醋酸 120 ml
甘油 900 ml
配制方法:將蘇木素溶于無水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水，溶解后將甘油傾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸鈉。
C:1%鹽酸酒精分化液:將1毫升濃鹽酸加入99毫升70%酒精中即可。
操作步驟
常規(guī)he染色步驟
(1)二甲苯(Ⅰ) 15min
(2) 二甲苯(Ⅱ) 15 min
(3)二甲苯:無水乙醇=1:1 2min
(4) 100%乙醇(Ⅰ) 5min
(5) 100%乙醇(Ⅱ) 5 min
(6) 80%乙醇 5min
(7) 蒸餾水 5 min
(8) 蘇木精液染色 5 min
(9) 水洗10 min 或流水沖洗5 min
(10) 1%鹽酸乙醇 30s
(11) 水洗 30 s
(12)蒸餾水過洗 5 s
(13) 0.5%伊紅液染色 1-3 min
(14) 蒸餾水稍洗 30 s
(15) 80%乙醇稍洗 30 s
(16) 95%乙醇(Ⅰ)1 min
(17) 95%乙醇() 1 min
(18) 無水乙醇 (Ⅰ)3 min
(19)無水乙醇(Ⅱ)3 min
(20)二甲苯(Ⅰ) 3 min
(21)二甲苯(Ⅱ) 3 min
(22)中性樹膠封固
冷凍切片HE染色步驟
(1)冰凍切片固定 10~30 s
(2)稍水洗 1~2 s
(3)蘇木精液染色(60℃) 30~60 s
(4)流水洗去蘇木精液 5~10 s
(5)1%鹽酸乙醇 1~3 s
(6)稍水洗 1~2 s
(7)促藍液返藍 5~10 s
(8)流水沖洗 15~30 s
(9)0.5%曙紅液染色 30~60 s
(10)蒸餾水稍洗 1~2 s
(11)80%乙醇 1~2 s
(12)95%乙醇 1~2 s
(13)無水乙醇 1~2 s
(14)石炭酸二甲苯 2~3 s
(15)二甲苯(Ⅰ) 2~3 s
(16)二甲苯(Ⅱ) 2~3 s
(17)中性樹膠封固。
注:第(14)步如果不用石炭酸二甲苯，可改用無水乙醇。
染色結(jié)果:細胞核藍色，胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈深淺不一的紅色。
注意事項
切片脫水透明 切片經(jīng)HE染色后，要徹底脫水透明，才能用中性樹膠封蓋。如果脫水不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下觀察模糊不清，且容易褪色。切片1-2級無水乙醇脫水，也可使用石炭酸二甲苯進行脫水。石炭酸有較強脫水能力，但長時間可使切片脫色，因此要經(jīng)過多次二甲苯以使石碳酸完全除去。
結(jié)果的判斷
實驗結(jié)果
細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍色，粘液呈灰藍色。細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。
著色情況與組織或細胞的種類有關(guān)，也隨其生活周期及病理變化而改變。例如，細胞在新生時期胞漿對伊紅著色較淡或輕度嗜堿，當其衰老時或發(fā)生退行性變則呈現(xiàn)嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現(xiàn)透明變性時，伊紅著色由淺變深。
H-E染色評定標準:
(1)切片完整，厚度4-6微米，厚薄均勻，無皺褶無刀痕;
(2)染色核漿分明，紅藍適度，透明潔凈，封裱美觀。
