石蠟組織切片的H E染色

一、實驗?zāi)康?/span>

蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)染色方法，簡稱HE染色方法，是常規(guī)病理制片最基本的染色，能夠?qū)φ＝M織和病理組織進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察。通過本實驗的學(xué)習(xí)，了解HE染色的方法，學(xué)會觀察正常組織和病理組織。

二、實驗原理

1、細(xì)胞核染色的原理：蘇木精為堿性天然染料，可使細(xì)胞核著色。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側(cè)帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。

2、細(xì)胞漿染色的原理：伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料，在一定條件下可使細(xì)胞漿著色。細(xì)胞漿的主要成分是蛋白質(zhì)，為兩性化合物，細(xì)胞漿的染色與染液的pH在胞漿蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（4.7—5.0）以下時，胞漿蛋白質(zhì)以堿式電離，則細(xì)胞漿帶正電荷，就可被帶負(fù)電荷的酸性染料染色。伊紅在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與胞漿蛋白質(zhì)帶正電荷的陽離子結(jié)合，使細(xì)胞漿著色，呈現(xiàn)紅色。

3、分化作用：染色后，用某些特定的溶液將組織過多結(jié)合的染色劑脫去，這個過程稱為分化作用，所用的溶液稱為分化液。在HE染色中用1%鹽酸乙醇作為分化液，因酸能破壞蘇木精的醌型結(jié)構(gòu)，使組織與色素分離而褪色。經(jīng)蘇木精染色后，必須用1%鹽酸乙醇分化，使細(xì)胞核過多結(jié)合的蘇木精染料和細(xì)胞漿吸附的蘇木精染料脫去，在進(jìn)行伊紅染色，才能保證細(xì)胞核與細(xì)胞漿染色的分明。因此，在HE染色中分化是極為關(guān)鍵的一步。

4、返藍(lán)作用：分化之后，蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，呈紅色，在堿性條件下處于藍(lán)色離子狀態(tài)，呈藍(lán)色。組織切片經(jīng)1%鹽酸乙醇分化后呈紅色或粉紅色，故分化之后，立即用水出去組織切片上的酸而終止分化，再用弱堿性水（0.2%氨水）使蘇木精染上的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，這個過程稱為返藍(lán)作用或藍(lán)化作用。另外用自來水浸洗也可使細(xì)胞核返藍(lán)，但所需時間較長。

三、實驗材料和試劑：

1、蘇木精染液：

蘇木精染液配制方法有多種，Harris蘇木精染液是最常用的一種，其配方如下：

蘇木精：1g

無水乙醇：10ml

硫酸鋁鉀：20g

蒸餾水：200ml

氧化汞：0.5g

冰醋酸：8ml

配制步驟：先用無水乙醇溶解蘇木精，用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，再將這兩種液體混合后煮沸（約1min），離火后向該混合液中迅速加入氧化汞，并用玻璃棒攪拌至染液變?yōu)樽霞t色（此時有大量氣泡產(chǎn)生，故容器宜大，以防液體溢出），隨即用冷水冷卻至室溫，然后加入冰醋酸并混勻，過濾后使用。

2、伊紅染液

伊紅染液有是水溶性和醇溶性兩種，常用的為0.5%水溶性伊紅染液，其配方如下：

伊紅Y：0.5g

蒸餾水：100ml

配制步驟：先用少許蒸餾水溶解伊紅Y，然后加入全部蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，過濾后使用（也可不過濾）。

3、1%鹽酸乙醇分化液

36%—38%鹽酸：1ml

75%乙醇：99ml

4、0.2%氨水（pH在7.5—8之間）

25%—28%氨水：0.2ml

自來水：100ml

四、染色步驟與方法：

1、烤片：1小時，溫度60℃（目的：使組織切片與載玻片貼合的更加緊密）

2、切片脫蠟至水：

     ①二甲苯Ⅰ：10min

      ②二甲苯Ⅱ：5—10min（時間長短視脫蠟情況而定）

      ③無水乙醇Ⅰ：3—5min

      ④無水乙醇Ⅱ：3—5min

      ⑤95%乙醇：3—5min

      ⑥95%乙醇：3—5min

      ⑦85%乙醇：3—5min

      ⑧75%乙醇：3—5min

⑨自來水洗：2min

3、染色：

      ①蘇木精染色：5—10min

      ②自來水洗：1min

      ③1%鹽酸乙醇分化：數(shù)秒

      ④自來水洗：1min

      ⑤0.2%氨水返藍(lán)：30s±

      ⑥自來水洗：1min

      ⑦伊紅染色：3—5min

      ⑧自來水洗：速洗

4、脫水、透明、封固

      ①80%乙醇：10—20s

      ②90%乙醇：10—20s

      ③95%乙醇Ⅰ：2—3min

      ④95%乙醇Ⅱ：2—3min

      ⑤無水乙醇Ⅰ：3—5min

      ⑥無水乙醇Ⅱ：3—5min

      ⑦二甲苯Ⅰ：3—5min

      ⑧二甲苯Ⅱ：3—5min

      ⑨二甲苯Ⅲ：3—5min

      ⑩中性樹膠封固

五、染色結(jié)果

細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈粉紅色至桃紅色，膠原纖維呈淡粉紅色，紅細(xì)胞呈較鮮艷的橘紅色。鈣鹽、細(xì)菌菌落呈藍(lán)色或紫藍(lán)色。

六、注意事項

1、染色前，切片脫蠟應(yīng)徹底。若脫蠟不徹底，則影響著色。

2、染色時間與染液的新舊程度有關(guān)，不能一成不變。新配制的染液著色力較強(qiáng)，染色時間可適當(dāng)縮短；反之，則適當(dāng)延長。伊紅染色程度應(yīng)以蘇木精對核的著色程度為參照標(biāo)準(zhǔn)，掌握其染色時間，已達(dá)到對比鮮明為宜。

3、伊紅染液的pH值不能低于細(xì)胞核染色體等電點(diǎn)（pI=3.3），否則染色體也可表現(xiàn)堿式電離帶正電荷，而被伊紅染液染色，使細(xì)胞漿與細(xì)胞核區(qū)分不開。因此伊紅染液的pH值應(yīng)小于胞漿蛋白等電點(diǎn)，而大于胞核染色體等電點(diǎn)，在3.6-4.7之間。

4、掌握好分化程度，分化時要認(rèn)真觀察，精心操作，觀察切片由深藍(lán)色變成紅色或粉紅色時，立即將切片置入自來水中終止分化。

5、封固用的中性樹膠的濃度要適宜，避免產(chǎn)生氣泡。如中性樹膠過稀，容易溢出蓋玻片的周圍，且樹膠內(nèi)的二甲苯易揮發(fā)，樹膠干燥濃縮后可產(chǎn)生氣泡。如中性樹膠過濃稠，滴后不容易擴(kuò)散，有氣泡不易排出。若封固后氣泡存留，既影響切片觀察，又影響切片保存。因此有氣泡產(chǎn)生時，應(yīng)輕輕按壓蓋玻片，將氣泡驅(qū)除。