『液基資料』宮頸細胞學的發(fā)展簡史和技術(shù)進展

　　  　孫耘田　　　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院病理科 100021 北京

一．巴氏刮片技術(shù)

現(xiàn)代細胞學之父，希臘醫(yī)生Papanicolaou（巴氏）上個世紀二十年代起在美國通過觀察豚鼠陰道脫落細胞的形態(tài)特點研究其生殖生理的周期性改變。后來，在婦產(chǎn)科醫(yī)生的協(xié)助下，他把這項研究應用到人類，觀察人類的陰道脫落細胞學，并通過細胞的形態(tài)特點了解女性激素的水平和影響。在對大量人群陰道脫落細胞的觀察和研究中，巴氏注意到一些形態(tài)異常的細胞，并進一步發(fā)現(xiàn)這些異常細胞來源于子宮頸癌患者。1941年他把這一成果發(fā)表于美國婦產(chǎn)科學雜志，首次闡述了陰道細胞學涂片對診斷子宮頸癌的價值。1巴氏的發(fā)現(xiàn)拓展了陰道（宮頸）脫落細胞學的應用領(lǐng)域，開創(chuàng)了宮頸細胞學、乃至整個現(xiàn)代診斷細胞學的新時代。

巴氏對陰道脫落細胞學的形態(tài)學改變采用五級分類，即未見癌細胞，輕度核異質(zhì)細胞（dyskaryosis），重度核異質(zhì)細胞，可疑癌細胞，可見癌細胞。在巴氏的理論和實踐基礎(chǔ)上，半個多世紀以來，人們對宮頸癌和癌前病變的細胞病理學基礎(chǔ)的認識不斷深入，宮頸細胞學的診斷術(shù)語、技術(shù)方法也在不斷發(fā)展。五十年代Reagan和Ng提出了宮頸上皮不典型增生（Dysplasia）的概念，用“輕度、中度和重度不典型增生”及“原位癌”四級分類作為子宮頸鱗狀細胞癌前病變的組織學分級。這些診斷術(shù)語又被用到宮頸細胞學的診斷中，用以代替巴氏分級中含義比較模糊的“核異質(zhì)”和“可疑癌細胞”的概念。六十年代后期，Richart提出了“宮頸上皮內(nèi)瘤變”（Cervical Intraepithelial Neoplasm, CIN）的概念，認為子宮頸癌前病變是一系列連續(xù)的、漸進的、發(fā)生于宮頸鱗狀上皮內(nèi)的瘤變過程。CIN分為1、2、3級，分別相對應于輕、中、重度不典型增生，CIN 3則還包括了原位癌。CIN的診斷術(shù)語也被細胞學報告所采用。過去有些組織病理學教科書說CIN 1（輕度不典型增生）是內(nèi)三分之一的被覆上皮細胞異常，CIN 2（中度不典型增生）是內(nèi)三分之二的被覆上皮細胞異常而其余細胞正常。事實上，在CIN 1或CIN2時，宮頸表層細胞不論其組織形態(tài)還是脫落細胞的形態(tài)都表現(xiàn)有不同程度的異常，細胞學據(jù)此可以診斷宮頸病變。細胞學采用組織病理學的報告方式更有利于醫(yī)學診斷術(shù)語的統(tǒng)一。

但是，直至上世紀九十年代，宮頸細胞學診斷并未形成統(tǒng)一規(guī)范。巴氏五級分類、不典型增生和原位癌的四級分類以及CIN的三級分類被同時并用，造成診斷術(shù)語的混亂，不利于醫(yī)生之間和醫(yī)患之間的交流。隨著對宮頸癌和癌前病變病因?qū)W的研究和分子生物學的進展，人們發(fā)現(xiàn)人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是宮頸癌和癌前病變的主要的致病因素。HPV感染可引致鱗狀細胞特征性的細胞形態(tài)學改變。人們還進一步發(fā)現(xiàn)CIN1、2、3并不是一組連續(xù)的漸進性病變，而更可能是兩類形態(tài)不同，程度不同、性質(zhì)也不相同的宮頸鱗狀細胞癌前病變，進而提出了上皮內(nèi)低度病變和高度病變的概念，這就是1988年首次提出的TBS系統(tǒng)（The Bethesda system）。TBS系統(tǒng)在1991年正式推廣應用，經(jīng)過10年的實踐在2001年得到進一步完善，目前全世界多數(shù)國家都采用這一模式提供描述性的細胞學診斷報告。TBS系統(tǒng)的詳細內(nèi)容在本書其他章節(jié)有系統(tǒng)介紹。

宮頸細胞學診斷報告的發(fā)展演化過程及其對應關(guān)系見表。

表  宮頸細胞學診斷宮頸癌前病變的術(shù)語演變和對應關(guān)系

傳統(tǒng)宮頸涂片技術(shù)幾乎被一成不變地沿用了將近五十年。八十年代中、后期，發(fā)生在美國的宮頸涂片診斷假陰性病例的報導，2引起了人們的震驚。當對宮頸細胞學診斷的特異性和敏感性進行分析時，發(fā)現(xiàn)不同實驗室均有相當可觀的誤診率。3

在對巴氏涂片技術(shù)的反思中，人們注意到假陰性病例的發(fā)生主要有三方面原因。

首先是標本取材中的問題。傳統(tǒng)的巴氏涂片利用不同式樣和質(zhì)地的取材器

從宮頸的上皮移行區(qū)采取細胞並涂于玻片上。在細胞轉(zhuǎn)移過程中有80%以上的細胞被殘留在取材器上扔掉了。異常的宮頸上皮細胞很可能滯留于取材器而未被轉(zhuǎn)移到玻片上。

其次是涂片質(zhì)量不好。轉(zhuǎn)移到玻片上的異常細胞可能互相重疊，或被炎細胞、血細胞覆蓋而難以發(fā)現(xiàn)或識別。涂片也可能固定不及時，細胞干燥，影響診斷。

第三是診斷的問題。由于細胞技術(shù)員或病理醫(yī)生的疏忽而未注意到本來可以發(fā)現(xiàn)的異常細胞，或者對發(fā)現(xiàn)的異常細胞未能做出正確的解釋，沒能及時做出準確診斷。值得注意的是，質(zhì)量不好的涂片也妨礙診斷水平的發(fā)揮。

針對巴氏涂片存在的問題，伴隨著計算機技術(shù)和自動化技術(shù)的發(fā)展，自二十世紀八十年代后期，人們對細胞學的樣本采集、制片技術(shù)及診斷程序不斷進行改進，一系列新技術(shù)應運而生。

二．計算機輔助閱片技術(shù)

八十年代后期，隨著計算機技術(shù)的發(fā)展和應用，Neuromedical Systems Inc研制了一種把顯微鏡和計算機連接在一起的“腦神經(jīng)網(wǎng)絡模擬系統(tǒng)”(PAPNET System, NSI Corp, Suffern, New York) 用以掃描傳統(tǒng)的宮頸涂片。4，5該系統(tǒng)對傳統(tǒng)的巴氏宮頸涂片在顯微鏡下進行電腦掃描。根據(jù)涂片面積大小，計算機可以將其分為3,000-5,000個區(qū)域，再按區(qū)域全面掃描。掃描過程分兩步進行，分別采用200倍和400倍放大，最后篩選出128個“病變”最明顯的細胞，通過自動對焦的數(shù)碼相機錄入計算機再刻錄到光盤上，整個過程約需8-10分鐘。

細胞病理醫(yī)生通過計算機顯示屏閱讀檢出的128個細胞。如發(fā)現(xiàn)可疑細胞，可借助自動定位系統(tǒng)，在原涂片上找到該細胞，由細胞病理醫(yī)生在顯微鏡下對該細胞、乃至整張涂片進行全面評估，進而做出正確診斷。該系統(tǒng)部分解決了早期研制的計算機閱片裝置對重疊細胞不能做出正確解釋的問題，在某些方面具有相似于人腦與眼之間的協(xié)調(diào)作用，故稱為腦神經(jīng)網(wǎng)絡模擬。但有研究表明，如果用PAPNET系統(tǒng)進行初篩，其敏感性反而低于有經(jīng)驗的專業(yè)人員。

美國食品及藥物管理局（FDA）1995年批準可以把PAPNET電腦顯微掃描儀用于實驗室的質(zhì)量控制工作中，利用該裝置對人工篩查陰性的宮頸涂片進行復查，以期檢出可能存在的假陰性病例。有證據(jù)表明，PAPNET系統(tǒng)在陰性涂片質(zhì)控復查中的敏感性相當于專業(yè)人工復查。6，7

PAPNET系統(tǒng)是在1995年由香港新順公司引進中國的，被簡稱為CCT檢查（Computer-assisted Cytology Test），很快在許多大、中城市中推廣，被應用于宮頸細胞學的初篩工作中。鑒于我國細胞學領(lǐng)域?qū)I(yè)人員短缺，現(xiàn)有人員訓練不足，水平參差不齊，把智能化的PAPNET系統(tǒng)用于宮頸細胞學的初篩，也有其較好的實用價值。8在實際應用中，許多細胞病理醫(yī)生在CCT掃描的基礎(chǔ)上，仍對涂片進行了全面人工檢查，以彌補機器初篩的不足。值得指出地是，隨著CCT技術(shù)的引進，與之相適應的宮頸細胞學診斷分類- TBS (The Bethesda System)系統(tǒng)（另文闡述）在中國得以進一步介紹和推廣，促進了中國細胞學人員水平的提高，也推動了細胞學在中國的發(fā)展。由于技術(shù)和商業(yè)等多方面的原因，2000年后，PAPNET系統(tǒng)已經(jīng)被新一代的細胞學自動掃描系統(tǒng)取代（詳見后文AutoPap）。

三．膜式液基薄層細胞制片技術(shù)（Thih-prep Cytolosy Test, TCT）

如前所述，傳統(tǒng)巴氏涂片出現(xiàn)漏診或誤診的主要原因是取材時的細胞丟失以及涂片質(zhì)量太差。低質(zhì)量和不規(guī)范的涂片也是細胞學診斷自動化的障礙。上個世紀九十年代以來，在制片技術(shù)改革方面有許多新的嘗試，其中比較有代表性的是美國Cytyc公司研制的ThinPrep膜式過濾技術(shù)。9

標本采集

臨床醫(yī)師在診室按通常方法采集子宮頸細胞樣本，但並不直接涂片，而是把采集器前端放入裝有含甲醇的細胞保存液的小瓶中漂洗，細胞被直接收集到的保存液中。細胞標本瓶送達細胞學實驗室后，采用ThinPrep2000自動制片機制片。

細胞混勻

在細胞標本瓶內(nèi)置入一個長6厘米、直徑2厘米、頂端有過濾膜的圓柱型過濾器。整個標本瓶連同過濾器被置于機器上。機軸帶動過濾器在瓶內(nèi)自轉(zhuǎn)而促使液體旋動，以分散粘液，混勻細胞，但又很柔和而不會損傷細胞，并足以保持成團的細胞如宮頸管細胞或化生細胞不被打散。細胞的負壓過濾膜采集細胞混勻后，過濾器停止轉(zhuǎn)動，負壓管開始抽吸，液體通過濾膜進入過濾器，細胞貼附在過濾膜的外表面。濾膜上均勻分布著直徑為5u（用于非婦科標本）和7u（用于婦科標本）的微孔，足以保證細胞成分不被漏過。

細胞轉(zhuǎn)移

當過濾膜被細胞復蓋后，過濾器自動提起并翻轉(zhuǎn)180°，與其上方預置的玻片接觸，依靠過濾器內(nèi)微弱的正壓和玻片與細胞間正、負電荷的作用，濾膜上的細胞被轉(zhuǎn)移到玻片上，在界定位置內(nèi)形成一個直徑2cm的細胞薄層。該系統(tǒng)每小時約可處理30份標本，巴士染色，光學顯微鏡人工觀察。該方法制成的細胞膜片具有傳統(tǒng)涂片無法比擬的優(yōu)點。1996年5月FDA批準把此法用于臨床，并指出ThinPrep 技術(shù)可代替?zhèn)鹘y(tǒng)巴氏涂片，并使宮頸低度病變和高度病變的檢出率有了顯著提高。10，11

在我國ThinPrep技術(shù)首先在中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院、北京協(xié)和醫(yī)院用于臨床檢測和科研工作中，並已取得了較好的結(jié)果。該技術(shù)的一個主要問題是機器和耗材成本較高，致使該項檢查的費用較高，在一定程度上影響了技術(shù)推廣。

四. 離心沉淀式液基薄層細胞學技術(shù)（AutoCyte Prep和CytoScreen）

AutoCyte Prep的細胞采集和保存過程與ThinPrep相似，即把細胞采集器直接放入裝有CytoRich細胞保存液的收集瓶內(nèi)。略有不同處是，本技術(shù)是將細胞采集器的前端折斷放入收集瓶內(nèi)，再經(jīng)過渦旋震蕩使采集器上的細胞進入瓶內(nèi)液體中。在此后的制片過程中AutoCyte采用了完全不同于ThinPrep的技術(shù)，可概括的稱之為離心沉淀技術(shù)。

自動化移液及梯度離心

AutoCyte Prep裝置是一個類似機器人式的自動化移液器，能自動完成標本的混懸，並將其移入盛有比重液（Density Reagent）的試管中，以便進行梯度離心，除去樣本中的非診斷性細胞碎屑、粘液、過多的炎細胞和血細胞，使有診斷價值的細胞富集于試管底部。

細胞沉降及染色

試管底部富集的細胞經(jīng)機械手裝置重新懸浮、混勻並被轉(zhuǎn)移到AutoCyte沉降管中。沉降管由直徑1.3cm的塑料環(huán)圍成，由金屬夾將其固定于涂有粘附劑的載玻片上。在沉降管中，細胞由于自然重力作用而沉降並粘附在載玻片上，形成一個直徑1.3cm的細胞薄層，直接在操作平臺上自動染色。該平臺最多容納48張載玻片，同時處理48份標本，整個過程約2.5小時。染色后的玻片從裝置中移出，經(jīng)二甲苯透明，樹膠封固后由人工在顯微鏡下檢查。

美國FDA 1998年通過了對AutoCyte Prep的認證，指出該裝置可替代傳統(tǒng)巴氏涂片，對各種病變的檢出率與傳統(tǒng)涂片類似。該裝置的機器和耗材成本相對較低，在某種意義上利于推廣。該項技術(shù)也已引入我國，用于臨床細胞學檢查和科研工作中。

此外，基于AutoCyte技術(shù)，法國、意大利聯(lián)合開發(fā)了CytoScreen技術(shù)。該技術(shù)也采用了離心沉淀原理，但與AutoCyte不同的是，它只對有血樣本進行比重液梯度離心，對大部分的標本則通過專用離心機自動處理，完成細胞沉淀過程，以減少細胞自然沉淀的不穩(wěn)定性。這樣制備的涂片與傳統(tǒng)細胞涂片的形態(tài)較為接近，使細胞學診斷人員能夠很快適應這一新的技術(shù)。但CytoScreen不具備自動染色功能。

TCT 和AutoCyte技術(shù)中的細胞保存液可以較好的保留細胞的DNA信息，可以直接用于雜交捕獲二代（HC2）方法測試標本中的 HPV DNA。液基薄層細胞學技術(shù)還可用于非婦科標本，如尿、痰、體腔滲出液、支氣管沖洗液、食管拉網(wǎng)標本以及細針穿刺的標本檢測。此外，在科研工作中，還可嘗試將該技術(shù)用于免疫組織化學、分子原位雜交、顯微形態(tài)測量以及流式細胞學檢查。

五. 計算機自動閱片裝置-AutoPap初篩系統(tǒng)

Auto Pap細胞學初篩系統(tǒng)（AutoPap Primary Screening System） 是繼PAPNET之后，在讀片技術(shù)自動化方面的一個重要進展。該系統(tǒng)既可以用于對傳統(tǒng)巴氏涂片的初篩，也可以用于液基薄層玻片。美國FDA在1998年批準AutoPap 可用于宮頸涂片的初篩工作，並批準經(jīng)AutoPap初篩確認的正常端的25%的病例可以不再經(jīng)過人工復查。其余的75%需再經(jīng)人工復查做出最后診斷。該系統(tǒng)的基本工作程序是：預設(shè)免檢范圍，AutoPap自動掃描系統(tǒng)通過其預先設(shè)計的標準，對宮頸涂片的細胞形態(tài)進行排隊分級。操作員可以預先設(shè)置系統(tǒng)的免檢范圍，即設(shè)定位于正常一端的一定比例的人群可以直接通過系統(tǒng)的篩查，免除人工復查。自然人群的宮頸細胞學在正常范圍之內(nèi)或呈良性反應性改變在75%以上。FDA規(guī)定，免檢人群的比例不應超過25%，以確保證足夠多的人群需經(jīng)過人工篩查，避免漏診。在實際工作中，可以根據(jù)篩查人群的特點或研究目的，把免檢范圍設(shè)定在0到25%之間的任一位置。

系統(tǒng)自動標記（PapMap）和標記視野篩查（PapMap-Fields of View  Screen）AutoPap系統(tǒng)進行自動篩查時能在需要人工復查的玻片上確認出最“不正?！钡?5個視野，並在玻片上做出標記。受過專門訓練的細胞學技術(shù)員只需要檢查這15個標記的視野。根據(jù)這15個視野做出的診斷稱之為標記視野篩查診斷（PapMap Fields of View Screening Diagnosis），其中包括不典型細胞或更為嚴重的病變。由對涂片全景的篩查進展為對系統(tǒng)自動標記區(qū)域的篩查，大大提高了工作效率。

4. 全玻片人工篩查

經(jīng)標記視野篩查檢出有不典型細胞或更嚴重病變的玻片要進行全玻片的人工復查，由此做出的診斷稱為系統(tǒng)定位指導的全片篩查診斷（AutoPap Location-Guided Screening Diagnosis）。研究表明，系統(tǒng)定位指導的全玻片篩查診斷較全人工篩查和標記視野篩查的敏感性和特異性高，證明了AutoPap的實用價值以及對視野標記細胞異常的病例進行全玻片復查的必要性。應該指出，不論是自動制片系統(tǒng)還是自動閱片系統(tǒng)都還處于初級階段，技術(shù)細節(jié)有待提高，產(chǎn)品成本也有待進一步降低。但是，高科技在細胞學發(fā)展中的應用已顯示出了巨大優(yōu)越性，學習、使用和提高這些技術(shù)已成為細胞病理學發(fā)展的必然趨勢。新技術(shù)的特點是高度自動化和標準化， 適于大批量集團作業(yè)。為了降低設(shè)備成本和人員培訓成本，提高細胞學診斷報告的準確性，提供最佳的質(zhì)量保證和符合市場規(guī)律的運行機制，建立細胞學診斷中心勢在必行。事實上，在過去的幾年中，在北京已經(jīng)有一些大醫(yī)院的病理科在起著這樣的作用。但現(xiàn)行的經(jīng)濟體制還未能使其發(fā)揮應有的作用。很多發(fā)達國家的細胞學診斷中心每年病例數(shù)達幾十萬或上百萬。我們的工作量遠遠低于這個數(shù)字，遠不能滿足人們對健康、保健的需求。細胞病理學中心集醫(yī)療、保健、科研和教學于一體，將促進我國的細胞病理學水平迅速達到世界先進水平。為了提高我國細胞病理學水平，我們不僅要學習和引進先進技術(shù)，更應該研究這些技術(shù)，開發(fā)新的產(chǎn)品，以降低成本，逐步實現(xiàn)設(shè)備和耗材的國有化。我國幅員廣大、人口眾多，經(jīng)濟發(fā)展極不平衡。在我們引進和宣傳先進技術(shù)的同時，一些傳統(tǒng)的、行之有效的、費用低廉的細胞學方法，如傳統(tǒng)巴氏涂片（Pap Smear）、細胞離心（Cytospin）等技術(shù)也不能放棄，以適應國情、滿足人們防癌普查、疾病診斷的不同需求。

宮頸細胞學的理論和技術(shù)在剛剛結(jié)束的上個世紀末取得了長足進展，推進了宮頸病變診斷和治療的規(guī)范化和標準化。宮頸細胞學在宮頸病變早期診斷中仍具有其他方法不能取代的作用。

參考文獻

1. Papanicolaou GN, Traut HF: The diagnostic value of vaginal smears in carcinoma of the uterus.  Am J Obst Gynec, 1941, 42:193-197.

2. Bogdanich W: Lax laboratories: the Pap test misses much cervical cancer through lab's errors.  Wall Street Journal, November 3, 1987

3. Koss LG: The Papanicolaou test for cervical cancer detection - a triumph and tragedy.  JAMA, 1989, 261:737-743.

4. Mango L: Computer-assisted cervical cancer screening using neural networks.  Cancer Letters, 1994, 77:155-158.

5. Mango L: Neuromedical Systems Inc. Acta Cytol, 1996, 40:53-59.

6. Koss L，Lin E. Schreiber K et al: Evaluation of the Papnet cytology screening system for quality control of cervical smears.  Am J Clin Pathol, 1994, 101:220-229.

7. Denaro TJ, Herriman JM, Shapira O: PAP-NET testing system technical update.  Acta Cytol, 1997, 41:65-73.

8. 程雪梅，郎景和，劉美芝：計算機細胞掃描在子宮頸病變診斷上的應用?，F(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，1996, 5:210-212,.

9. Hutchinson ML: A new look at cervical cytology: ThinPrep multicenter trial results. Acta Cytol, 1992, 36:499-504.

10. Wilbur DC: ThinPrep processor: clinical trials demonstrates an increased detection rate of abnormal cervical cytologic specimens. Am J   Clin Path, 1994, 101:209-214.

11. Laverty CR, Roberts JM, Gurley AM, Thurloe JK, Bowditch R: Liquid based cytology - Comparison of ThinPrep 2000 with conventional Pap smears. Presented at 3rd International Congress on Lower Genital Tract Infections and Neoplasia (Eurogin).  Paris. April, 1997.

12. 潘秦鏡，李凌，喬友林，章文華，張洵，吳令英，李愛玲，戎壽德，趙芳輝，孫耘田：液基細胞學篩查宮頸癌的研究. 中華腫瘤雜志，2001, 23:309-312.

13. Laverty CR, Farnsworth A, Thurloe JK, Grieves A, Bowditch R: Evalustion of the CytoRich slide preparation process. Analyt Quant Cytol Histol, 1997, 19:239-245.

14. Wilbur DC, Facik MS, Rutkowski MA, Mulford DK, Atkison KM: Clinical trials of the CytoRich specimen-preparation device for cervical cytology. Preliminary results. Acta Cytol, 1997, 41:24-29.

15.Patten SF, Lee LJL, Nelson AC: Neopath Inc. Neopath Autopap 300 automated pap screener system. Acta Cytol, 1996, 40:45-52.

16. Lee JSJ, Kuan L, Oh S, Patten FW, Wilbur DC: A feasibility study of the AutoPap system location-guided screening. Acta Cytol, 1998, 42:221-228.

17. Huang TW, Lin TS-M, Lee JS-J: Sensitivity studies of AutoPap system location-guided screening of cervical vaginal cytologic smears. Acta Cytol, 1999, 43:363-369.